ヘモグロビン電気泳動実験

実験原理

ヘモグロビン電気泳動は、さまざまな正常および異常なヘモグロビンを検出および確認することを目的としています。

ヘモグロビンの種類によって電荷と等電点が異なるため、特定の pH 緩衝液では、ヘモグロビンの等電点が緩衝液の pH よりも低い場合、ヘモグロビンは負の電荷を帯び、電気泳動中にアノードに向かって移動します。逆に、正電荷を持ったヘモグロビンは陰極に向かって移動します。

特定の電圧下で特定の電気泳動時間の後、電荷と分子量が異なるヘモグロビンは、異なる移動方向と速度を示します。これにより、個別のゾーンの分離が可能になり、その後の比色分析または電気泳動スキャン分析をこれらのゾーンに対して実行して、さまざまなヘモグロビンを定量化できます。最も一般的に使用される方法は、pH 8.6 酢酸セルロース膜電気泳動です。

細胞質内では、グリコーゲンや多糖類（ムコ多糖、ムコタンパク質、糖タンパク質、糖脂質など）に存在するエチレングリコール基（CHOH-CHOH）が過ヨウ素酸により酸化され、アルデヒド基（CHO-CHO）に変換されます。これらのアルデヒド基は無色の紫がかった赤のシッフ試薬と結合し、細胞内の多糖が存在する場所に沈着する赤紫の色素を形成します。この反応は過ヨウ素酸シッフ (PAS) 染色として知られ、以前はグリコーゲン染色と呼ばれていました。

実験方法

材料:酢酸セルロース私ブレーン、電気泳動装置(DYCP-38Cと電源DYY-6C), 優れたサンプルローディングツール(ピペット)、分光光度計、比色キュベット, バッファー。

バッファ：

(1) pH 8.6 TEB 緩衝液: 10.29 g の Tris、0.6 g EDTA、3.2 g のホウ酸を秤量し、蒸留水を加えて 1000 ml にします。

(2) ホウ酸緩衝液：ホウ砂 6.87 g、ホウ酸 5.56 g を秤量し、蒸留水を加えて 1000 ml とする。

手順：

Pヘモグロビン溶液の調製

抗凝固剤としてヘパリンまたはクエン酸ナトリウムを含む血液を 3 ml 採取します。 2000 rpm で 10 分間遠心分離し、血漿を廃棄します。赤血球を生理食塩水で 3 回洗浄します (750 rpm、各回 5 分間遠心分離)。 2200 rpm で 10 分間遠心分離し、上清を捨てます。同量の蒸留水を加えた後、0.5倍量の四塩化炭素を加えます。 5 分間激しく振盪し、2200 rpm で 10 分間遠心分離して、後で使用するために上層の Hb 溶液を収集します。

膜を浸す

酢酸セルロース膜を 3 cm × 8 cm の短冊状に切ります。それらを完全に飽和するまで pH 8.6 TEB 緩衝液に浸し、その後取り出して濾紙で吸い取り乾燥させます。

スポッティング

ピペットを使用して、ヘモグロビン溶液 10 μl を酢酸セルロース膜 (粗い面) の端から約 1.5 cm に垂直にスポットします。

電気泳動

ホウ酸緩衝液を電気泳動チャンバーに注ぎます。セルロースアセテート膜のスポット面をチャンバーの陰極端に置きます。 200 V で 30 分間実行します。

溶出

HbA ゾーンと HbA2 ゾーンを切り出し、別々の試験管に入れ、それぞれ 15 ml と 3 ml の蒸留水を加えます。軽く振ってヘモグロビンを完全に溶出し、混合します。.

測色

溶出液に蒸留水を用いて吸光度をゼロにし、415nmでの吸光度を測定します。

計算

HbA2(%) = HbA2 チューブの吸光度 / (HbA チューブの吸光度 × 5 + HbA2 チューブの吸光度) × 100%

実験結果の計算

pH 8.6 TEB 緩衝液酢酸セルロース電気泳動の基準範囲: HbA > 95%、HbA2 1% ～ 3.1%

注意事項

電気泳動時間は長すぎてはなりません。酢酸セルロース膜は電気泳動中に乾燥してはなりません。 HbA と HbA2 が明確に分離されたら、電気泳動を停止します。電気泳動を長時間続けると、バンドの拡散やぼやけが発生する可能性があります。

サンプルを多量に使用しないでください。ヘモグロビン液が過剰になると、バンドの剥離や染色不足が生じ、HbA レベルが誤って上昇する可能性があります。

酢酸セルロース膜へのタンパク質の汚染を防ぎます。

電流が高すぎてはなりません。そうしないと、ヘモグロビンのバンドが分離しない可能性があります。

常に正常な個人からの検体と、必要な既知の異常ヘモグロビンを対照として含めてください。

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