アガロースゲル電気泳動の基本テクニック(2)

サンプルの準備と読み込み中

ほとんどの場合、ゲルを積み重ねずに連続バッファーシステムを使用するため、サンプルは適切な濃度と少量にする必要があります。を使用してくださいピペット分解能の大幅な低下を避けるために、サンプルを 1 ウェルあたり 5 ～ 10 μg ずつゆっくりと加えます。いつサンプルのロード、電源をオフにする必要があります。サンプルには、密度を高め、サンプルを濃縮し、拡散を防ぐために、指示薬色素 (0.025% ブロモフェノール ブルーまたはオレンジ) およびスクロース (10 ～ 15%) またはグリセロール (5 ～ 10%) が含まれている必要があります。ただし、スクロースまたはグリセロールによって電気泳動の結果に U 字型のバンドが発生する場合がありますが、これは 2.5% Ficoll (ポリビニルピロリドン) を使用することで回避できます。

電気泳動

電気泳動の電圧は 5 ～ 15 V/cm、一般的には 10 V/cm 程度です。大きな分子を分離するには、電圧を低くする必要があり、通常は 5 V/cm を超えてはなりません。

染色

アガロースゲル内の DNA バンドを観察するための染色には、蛍光色素エチジウムブロマイド (EB) が一般的に使用されます。 EB は DNA 分子の塩基対の間に挿入することができ、EB を DNA と結合させます。 DNAによる260 nmの紫外光の吸収はEBに伝達され、結合したEBは可視光スペクトルの赤オレンジ色領域の590 nmで蛍光を発します。 1 mmol/L MgSO4 溶液でゲルを 1 時間染色すると、結合していない EB によって引き起こされるバックグラウンド蛍光が減少し、少量の DNA の検出が容易になります。

EB 色素にはいくつかの利点があります。使いやすく、核酸を破壊せず、感度が高く、DNA と RNA の両方を染色できます。 EB をサンプルに添加し、いつでも UV 吸収を使用して追跡できます。染色後、n-ブタノールで抽出することでEBを除去できます。

ただし、EB 色素は強力な変異原性があるため、取り扱う際にはポリエチレン手袋を着用するなどの注意が必要です。アクリジン オレンジも、一本鎖と二本鎖の核酸 (DNA、RNA) を区別できるため、一般的に使用される色素です。二本鎖核酸の場合は緑色蛍光 (530 nm)、一本鎖核酸の場合は赤色蛍光 (640 nm) を示します。さらに、メチレン ブルー、メチレン グリーン、キノリン B などの他の染料も染色に使用できます。

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